La Diagnosi di Discinesia Ciliare Primaria

(Tutti gli esami descritti possono essere eseguiti presso il nostro Centro)
 

- Quando sospettare la DCP
- I test di screening
- I test diagnostici
-
Le colture cellulari
- Le indagini genetiche


Quando sospettare la DCP      ^torna su^               
 

I bambini con DCP possono essere asintomatici alla nascita, ma frequentemente presentano distress respiratorio già nel periodo neonatale. Essi tendono a presentare precocemente infezioni ricorrenti delle vie aeree inferiori, per cui la tosse catarrale è spesso il sintomo preminente, e a sviluppare bronchite cronica che nel corso degli anni può progredire verso la formazione di bronchiectasie.
Sono inoltre frequenti
otite media ricorrente, sinusite cronica e poliposi nasale. In questi bambini di solito sono presenti secrezioni muco-purulente nelle cavità nasali e sono comuni ostruzione nasale, rinorrea, gocciolamento di muco dalle fosse nasali posteriori sul retrofaringe ed anosmia. I maschi sono quasi sempre infertili, avendo un numero normale di spermatozoi ma con alterata motilità. Le femmine invece abitualmente sono fertili nonostante il possibile danno della funzione ciliare a livello delle tube di Falloppio.
In generale, comunque, le caratteristiche cliniche della DCP non differiscono da quelle riscontrate in pazienti con patologia respiratoria cronica in cui le alterazioni ciliari che spesso si riscontrano sono tipicamente secondarie.
Tuttavia, alcuni elementi clinici vanno opportunamente valorizzati ai fini diagnostici (Tabella I).
La diagnosi è certamente più facile quando è presente una malrotazione dei visceri interni, con destrocardia e situs inversus addominale o totale, condizione che si realizzerebbe per la mancata influenza del movimento delle ciglia embrionali nell’abituale distribuzione asimmetrica degli organi interni.
Del resto, recentemente, è emerso quanto il problema della diagnosi precoce di questa condizione patologica, sebbene rara, sia rilevante dalla osservazione di una sua elevata incidenza (5.6%) nei bambini con infezioni respiratorie ricorrenti e dalla dimostrazione di un progressivo deterioramento della funzione polmonare che appare tanto maggiore quanto più tardiva è la diagnosi e l’istituzione di un adeguato trattamento. Siamo, inoltre, consapevoli che la clearance muco-ciliare può anche essere compromessa, come abbiamo già detto, dall'esposizione ad agenti fisici o chimici (danno ossidativo, danno da pollutanti) e biologici (noxae infettive quali il Virus Respiratorio Sinciziale, l’Adenovirus tipo I, l’Haemophilus influnzae, la Chlamydia pneumoniae), per cui è necessario che venga posta una accurata diagnosi differenziale tra patologia ciliare primaria e secondaria.



ELEMENTI CLINICI INDICATIVI PER DCP

- Distress respiratorio neonatale in nati a termine (senza altra causa)
- Rinite persistente a esordio neonatale
- Situs viscerum inversus
- Tosse catarrale persistente
- Otiti ricorrenti
- Otorrea prolungata dopo inserzione di tubo trans-timpanico
- Bronchiectasie senza causa definita
- Bronco-ostruzione ricorrente refrattaria al trattamento antiasmatico
- Uso frequente di antibiotici per problemi respiratori

Tabella I

Come confermare il sospetto clinico      ^torna su^                 

Nei casi in cui è presente un fondato sospetto e siano state escluse altre cause compatibili con il quadro clinico (per es., fibrosi cistica, deficit immunitari), alcune semplici indagini di screening possono risultare utili ai fini di un indirizzo diagnostico. Per la diagnosi di certezza è tuttavia necessario completare gli accertamenti con indagini più sofisticate.

I test di screening

Valutazione del trasporto muco-ciliare
- Si basa sulla valutazione del tempo che intercorre tra il posizionamento di una determinata sostanza a livello del turbinato nasale inferiore e la rilevazione della stessa nel cavo orofaringeo, attraverso la percezione del sapore da parte del soggetto o l'osservazione del colore della sostanza medesima.

- Un approccio più obiettivo alla valutazione del trasporto muco-ciliare nasale in vivo utilizza la scintigrafia con tecnezio-99. Una goccia di una sospensione di particelle colloidali marcate con tecnezio-99 viene posta circa 1 cm al di dietro della giunzione mucocutanea della cavità nasale sul turbinato inferiore o lungo il pavimento laterale. Il movimento della radioattività è registrato mediante gamma camera, posta ipsilateralmente alla narice in cui è stato posizionato l’isotopo, con immagini ottenute ogni 30 secondi per un periodo di 10 minuti. Questo test, a differenza del precedente, non richiede la collaborazione del paziente non essendo influenzato dal pianto, dalla starnutazione e dalla tosse. L’elevata sensibilità di questo test, che pure ha una bassa specificità, consente di escludere la DCP quando risulta normale.

Determinazione dell’ossido nitrico nasale
La determinazione dell’ossido nitrico (NO) nasale può essere effettuata fin dai primi mesi di vita. L’NO è prodotto fisiologicamente dalla NO-sintetasi a livello del corpuscolo basale delle ciglia dell’epitelio respiratorio e svolge un ruolo importante nella modulazione del battito ciliare. Nella DCP i livelli di NO nasale sono tipicamente ridotti (inferiori a 250 ppb).
È comunque opportuno ricordare che l’anormalità sia dei test relativi al trasporto muco-ciliare sia della determinazione del NO nasale non è esclusiva della DCP, in quanto valori alterati possono riscontrarsi anche in altre condizioni patologiche (fibrosi cistica, rinosinusiti ecc.).

I test diagnostici       ^torna su^                 

Analisi dell’attività ciliare
Poiché, come si è detto, le ciglia rivestono l'epitelio della mucosa respiratoria dalle cavità nasali fino ai bronchioli respiratori ed ogni cellula epiteliale porta sulla sua superficie apicale circa 250-300 ciglia, nel bambino è conveniente evitare un eccessivo disagio eseguendo il prelievo dei campioni da analizzare a livello dei turbinati nasali inferiori, mediante uno spazzolino citologico come descritto da Rutland e Cole. La tecnica del brushing nasale è, infatti, semplice, poco invasiva e non richiede anestesia.

 

 

 

 

 

 

 

 

Brushing nasale

Tuttavia è necessario osservare tutta una serie di accorgimenti, in quanto, di fatto, il momento del campionamento è cruciale per la buona esecuzione delle valutazioni successive.
Innanzitutto, va ricordato che è preferibile prelevare la mucosa quando il bambino è il più possibile in buona salute, ovvero lontano da infezioni respiratorie o da riacutizzazioni di una patologia cronica, e, per evitare interferenze, non abbia assunto farmaci da almeno 48 ore. il campione di mucosa nasale viene considerato idoneo per le valutazioni delle ciglia respiratorie poiché è stata dimostrata l’esistenza di una correlazione statisticamente significativa tra le alterazioni ultrastrutturali delle ciglia nasali e quelle osservate in campioni prelevati negli stessi soggetti a livello bronchiale.
I campioni prelevati vengono quindi messi in sospensione in un mezzo di coltura per la immediata valutazione al microscopio ottico ed una parte di essi sarà eventualmente disponibile per l’esame ultrastrutturale al microscopio elettronico a trasmissione. Quindi si procede ad una blanda centrifugazione per 1 minuto allo scopo di ottenere la sedimentazione del campione che sarà prelevato per l'osservazione diretta mediante una pipetta Pasteur. A questo scopo viene utilizzato un microscopio ottico dotato di contrasto interferenziale di fase secondo Nomarsky e di obiettivo ad immersione. Il microscopio è connesso con una videocamera digitale a colori che consente la ripresa in tempo reale delle immagini ad elevato ingrandimento. Queste vengono inviate ad un elaboratore digitale che consente di migliorarne la qualità di visualizzazione, aumentando da 5-8 µm a 3-5 cm le dimensioni delle ciglia sul monitor. Le immagini selezionate vengono quindi archiviate mediante videoregistratore digitale ad una frequenza di 25 frames/sec per essere successivamente analizzate a velocità ridotta.

Nella DCP abitualmente si osservano valori di frequenza del battito ciliare estremamente bassi se non addirittura la presenza esclusiva di ciglia immobili.
Nella DCP sono state riscontrate diverse anomalie del pattern motorio:

- 1. “a frullino”, caratterizzato da una rotazione multiplanare della porzione intermedia del ciglio, mentre l’apice e la base rimangono sullo stesso piano;
- 2. “a metronomo”, caratterizzato da un movimento di tipo vibratorio in cui le ciglia sono piegate solo nella loro metà distale e appaiono rigide, muovendosi attraverso un arco ristretto su piani differenti;
- 3. “a cavaturaccioli”, caratterizzato da una rotazione bifasica a spirale lungo l’asse maggiore del ciglio, con movimento nella porzione distale e prossimale a differente velocità e movimento dell’apice e della base attraverso un arco ristretto;
- 4. “di prensione dell’apice”, in cui il ciglio è piegato nel mezzo, con metà inferiore rigida che si muove attraverso un arco molto stretto e metà superiore mobile in cui il piegamento è seguito da un movimento di rialzamento in avanti. Non vi è metacronicità delle onde e il movimento avviene su piani diversi tra ciglia adiacenti;
- 5. “di sottile tremolio”, caratterizzato da un movimento che conserva il proprio sincronismo, ma ad alta frequenza e di ampiezza molto ridotta.
Altre anomalie del battito ciliare recentemente descritte sono:
- 1. “rigido movimento vibratorio”, caratterizzato da ciglia virtualmente immobili, con movimento lento, occasionale e di bassa ampiezza.
- 2. “rigido movimento su un piano”, caratterizzato da un movimento in avanti ed indietro, di ampiezza ridotta;
- 3. “movimento rotazionale”, caratterizzato da un movimento circolare intorno alla base ciliare.

 

 

 

 


Anomalie del pattern motorio ciliare:
 A frullino, B metronomo, C cavaturaccioli, D prensione dell’apice, E sottile tremolio

Il tipo di movimento o la presenza di ciglia immobili viene giudicata significativa se è osservata in almeno il 40% dei campi microscopici. Tali difetti del pattern motorio sono stati correlati, anche se non sempre, con specifiche alterazioni della ultrastruttura ciliare. La DCP può essere inoltre dovuta alla perdita del normale orientamento ciliare con alterazione dei reciproci rapporti tra le ciglia che determina la mancanza di sincronismo nel movimento.
Per quanto riguarda gli aspetti morfologici evidenziati in contrasto di fase assume importanza il rilievo di ciglia ispessite e di aree di disepitelizzazione che di solito depone per la presenza di una flogosi in atto. L’analisi dell’attività e della morfologia ciliare eseguite con la metodica descritta offrono indubbi vantaggi, quali la possibile applicazione nel bambino non collaborante, la scarsa invasività dell’indagine e la buona riproducibilità dei risultati, tuttavia queste richiedono una strumentazione costosa ed appaiono tecnicamente complesse per cui debbono essere eseguite da operatori esperti. Esiste comunque sempre il rischio di incorrere in errori interpretativi per la possibile focalità delle alterazioni. L’analisi dell’attività ciliare in vitro con la valutazione della frequenza del battito ciliare e del pattern di movimento riveste un ruolo importante nell’iter diagnostico della DCP.
Infatti, se è vero che può rappresentare un’indagine di screening allo scopo di individuare i soggetti da sottoporre ad esame morfometrico ultrastrutturale delle ciglia dell’epitelio respiratorio, tale analisi è anche essenziale per giungere ad una diagnosi di certezza. A questo scopo nei soggetti con significative alterazioni del movimento ciliare, nei quali non siano dimostrabili anomalie ultrastrutturali patognomoniche per DCP, viene proposta la ripetizione dell’analisi dell’attività ciliare in vitro dopo un prolungato periodo di trattamento fisioterapico e farmacologico. La diagnosi di DCP potrà essere comunque confermata mediante indagini relative al trasporto mucociliare in vivo ed eventualmente attraverso la ripetizione dell’esame morfometrico ultrastrutturale su campioni prelevati a livello tracheo-bronchiale.

Esame Ultrastrutturale delle ciglia dell’epitelio respiratorio
(Il campione viene inviato alla Dottoressa Angela Cangiotti, presso l'Azienda Ospedaliero-Universitaria - Ospedali Riuniti di Ancona)

Una parte delle cellule poste nel mezzo di coltura dopo il prelievo potrà essere utilizzata per l’esame ultrastrutturale al microscopio elettronico a trasmissione.
Il materiale biologico dovrà, però, essere trattato nel modo seguente: dopo aver tolto lentamente il sovranatante, si inclina leggermente la provetta contenente il campione sedimentato e si aggiunge il fissativo (glutaraldeide al 2% e paraformaldeide al 2% in tampone fosfato 0,15M) facendolo scorrere lungo la parete per evitare che le cellule vengano ri-sospese. È necessario, quindi, mantenere la provetta in frigorifero a 4°C per 1-2 ore. Dopo una fissazione di almeno 3 ore a 4°C, il materiale biologico viene post-fissato in osmio tetrossido all’1% più ferrocianuro all’1%, disidratato in alcool a gradazione crescente ed incluso in una miscela di epon-araldite.
Per ogni prelievo vengono eseguite diverse sezioni semifini del materiale biologico, colorate con blu di toluidina e osservate al microscopio ottico. Le sezioni semifini sono di orientamento e servono all’operatore per scegliere il campo migliore da osservare al microscopio elettronico. Nel nostro caso il campo migliore è quello in cui le ciglia sembrano essere orientate il più possibile in modo trasversale poiché le sezioni utili per lo studio ultrastrutturale sono quelle che interessano l’assonema nella sua porzione intermedia, considerando che in quella prossimale e distale sono fisiologicamente presenti modificazioni strutturali che ostacolano il giudizio diagnostico.
Le sezioni fini vengono tagliate con Ultratome III LKB e quindi colorate con piombo citrato per l’indagine ultrastrutturale. Tutte le sezioni così ottenute sono studiate al microscopio elettronico a trasmissione (TEM: Philips CM10, Philips EM208).
Le ciglia sono osservate e quindi fotografate, ad ingrandimenti iniziali variabili da 45000 a 91000. I dati qualitativi e quantitativi relativi a ciascun caso sono raccolti in un’apposita tabella delle lesioni ciliari.
Per effettuare un esatto inquadramento nosologico del caso in esame riteniamo sia indispensabile studiare almeno 70 assonemi adeguatamente sezionati, anche se abitualmente ne vengono esaminati molti di più (in media 125 assonemi in 15 cellule ciliate).
Le anomalie ultrastrutturali caratteristiche di patologia ciliare congenita, riviste da Afzelius nel 1987 ed universalmente confermate dagli altri Autori, sono rappresentate da:
- 1. assenza dei bracci interno ed esterno di dineina;
- 2. riduzione del numero dei bracci di dineina sia interno che esterno, spesso del 50% circa;
- 3. accorciamento dei bracci esterni e possibile assenza di quelli interni;
- 4. assenza dei soli bracci esterni;
- 5. assenza dei soli bracci interni;
- 6. assenza dei ponti radiali o solamente delle loro teste e/o assenza della guaina centrale con conseguente decentramento dei microtubuli centrali (difetto dei ponti radiali);
- 7. assenza o accorciamento dei microtubuli centrali e spostamento della coppia n. 1 di microtubuli periferici al centro (trasposizione);
- 8. assenza dei legami di nexina, dei ponti radiali, dei bracci interni di dineina, con conseguente perdita della disposizione circolare delle coppie di microtubuli e “disorganizzazione” dell’assonema;
- 9. assenza dei microtubuli centrali e dei bracci interni di dineina;
- 10. presenza di una normale ultrastruttura delle ciglia in sezione trasversale, che comunque si associa a una immobilità o ipermotilità delle stesse con conseguente perdita della loro funzione di difesa. In alcuni casi le ciglia hanno una lunghezza approssimativamente 2 volte il normale;
- 11. assenza delle ciglia e dei relativi corpuscoli basali. In questo caso le cellule ciliate possono essere sostituite da cellule provviste di lunghi microvilli;
- 12. alterazione del normale orientamento delle ciglia. Infatti la direzione della flessione sembra determinata dall’orientamento della coppia centrale di microtubuli e lo sforzo attivo avviene nel piano che passa tra i due.

 

 

 

 

 

 

 

 

Nell'immagine a sinistra: assenza dei bracci interno ed esterno di dineina e della coppia centrale (Dott.ssa Angela Cangiotti - Ancona) 
Nell'immagine a destra: swollen cilia (Dott.ssa Angela Cangiotti - Ancona) 

Lo studio ultrastrutturale di un numero sempre più vasto di casi ha permesso di evidenziare accanto a quelle congenite, tutta una serie di alterazioni secondarie, aspecifiche, strettamente correlate allo stato di flogosi, presenti fino a un 10% anche nelle ciglia di soggetti normali ed in percentuale maggiore nei vari tipi di patologia acquisita, sia acuta che cronica, dell’apparato respiratorio (discinesie ciliari secondarie; DCS).
Il pattern di queste lesioni è sostanzialmente diverso da quello rilevato nelle forme congenite ed è rappresentato da:
- 1. swollen cilia, ciglia con aumento della matrice citoplasmatica
- 2. assonemi multipli, cioè ciglia che contengono più di un assonema completo o incompleto all’interno di una singola membrana;
- 3. ciglia intracitoplasmatiche, cioè ciglia che si proiettano in larghe cavità intracellulari;
- 4. alterazioni a carico delle coppie periferiche (una o più coppie periferiche assenti o aggiuntive, uno o più microtubuli periferici assenti o aggiuntivi);
- 5. dislocazione di una o più coppie periferiche;
- 6. microtubuli incompleti;
- 7. alterazioni delle coppie o dei microtubuli centrali (coppia o microtubulo centrale assenti o aggiuntivi).
Tali alterazioni possono presentarsi singolarmente o variamente associate nello stesso assonema.
Nel corso del tempo è stato infine dimostrata in un gruppo di soggetti anche la possibile presenza di un pattern intermedio, con lesioni ultrastrutturali tipiche della DCP, ma in bassa quantità, definito per comodità di tipo “borderline”. Più propriamente tali soggetti presentano una percentuale di elementi patologici superiore a quella riscontrata nelle forme acquisite di flogosi cronica ed un pattern ultrastrutturale caratterizzato dalla presenza di alterazioni “specifiche” dei bracci di dineina e/o della coppia centrale a distribuzione focale, associato ad un numero variabile di lesioni secondarie, aspecifiche. Tale gruppo, eterogeneo dal punto di vista clinico, verosimilmente comprende sia soggetti con una maggiore predisposizione ad ammalarsi ed una minore tendenza alla risoluzione del quadro clinico, sia soggetti con deficit congenito parziale. La patologia della coppia centrale e della dineina, infatti, secondo alcuni Autori, sarebbe compatibile anche con una condizione di particolare gravità della flogosi.
La microscopia elettronica delle ciglia respiratorie riveste quindi un ruolo essenziale nella diagnosi della DCP, soprattutto se viene eseguita una valutazione quantitativa delle lesioni. Infatti, oggi sappiamo che alterazioni abitualmente considerate di natura congenita, quali la traslocazione, la trasposizione, l’aplasia ciliare e l’alterato orientamento possono essere anche conseguenza di una flogosi cronica e che l’adeguata interpretazione di tali quadri è possibile solo con il ricorso ad un esame morfometrico.
L'adeguatezza delle indagini diagnostiche descritte è dimostrata dal possibile riscontro di una correlazione tra alterazioni ultrastrutturali e del movimento ciliare.

 

 

 

 

 

 

 


 



Le colture cellulari
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Nei casi in cui la diagnosi di Discinesia Ciliare Primaria risulti particolarmente complessa a causa di un esame ultrastrutturale non conclusivo e un esame dell'attività ciliare influenzato da una importante flogosi persistente a livello delle cavità nasali, viene da noi proposta una rivalutazione a distanza di tempo e nelle migliori condizioni possibili, dopo un trattamento farmacologico e fisioterapico mirati.
In alternativa, recentemente, abbiamo impiegato a scopo diagnostico le colture delle cellule ciliate prelevate a livello dei turbinati nasali allo scopo di valutare le varie tappe della ciliogenesi, ovvero la capacità di rigenerazione delle ciglia in un ambiente privo di noxae patogene (in questi casi le cilia presentano alterazioni della attività compatibili sia con la Discinesia Ciliare Primaria sia con le forme secondarie ad aggressioni ambientali. Tale tipo di metodica ha consentito di porre diagnosi di certezza in alcuni casi difficili da classificare. Pertanto riteniamo che questa possa da un lato ridurre i disagi del paziente, e dall'altro offrire agli operatori la possibilità di porre diagnosi e di farlo più precocemente.       

 iter

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 




Iter diagnostico utilizzato nei casi di difficile inquadramento

Le indagini genetiche      ^torna su^                 

(Dott.ssa A. Michelucci - U.O. Laboratorio di Genetica Medica - Direttore: Dott.ssa A. Caligo - Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana)

Per la caratterizzazione genetica e per la conferma diagnostica viene, inoltre, eseguita l'analisi mutazionale dei seguenti geni
responsabili della DCP: 

DNAH5                     - DNAH1
- DNAH8                    
DNAH11
DNAI1                  - DNAI2
DNAL1                      - TXNDC3 (NME8)
- RSPH4A                    - RSPH9
- RSPH1                      - RSPH3
- CCDC39                    - CCDC40
- CCDC164
(DRC1)   - CCDC103
- CCDC114                  - CCDC151
- HYDIN                      - ARMC4
- DNAAF1
(LRCC50) - DNAAF2 (KTU)
- DNAAF3                    - HEATR2 (DNAAF4)
- LRRC6                      - ZYMND10
- SPAG1                      - C21orf59
- DYX1C1                   - CCDC65
(DRC2)
- CCNO                       - MCIDAS
- GAS8
(DRC4)          - RPGR
- OFD1


              

 

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